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书页号：E6-附录4
本试验法包括牛奶凝固力、乳酸鉴别法、活乳酸菌数测定法及鉴别法。
一、牛奶凝固力及乳酸鉴别法
1.牛奶培养基的制备 取脱脂奶粉,制成1015％的溶液分装于试管中,每管20ml,用115℃蒸汽灭菌20分钟。
2.试验法 (1)牛奶凝固力　取供试品0.1～0.3g，加至牛奶培养基20ml中，摇匀,在37℃培养48小时(必要时可延长至72小时)，同时作两管，作为供试品管，以牛奶培养基为对照管，供试品管的牛奶应呈正常凝固现象（表面无多量乳清分出，凝块均匀稠密结实，无气体产生，无消化现象）。
(2)乳酸鉴别　取上述供试品管和对照管的培养液各1ml，分别注入两支试管 (15×160mm)中，各加10％硫酸溶液3～5滴，振摇，加乙醚约10ml，猛烈振摇，放置数分钟，分别将上层乙醚液倒入两支试管(16×180mm)中，于热水浴中,除去乙醚。残留物中各加水2ml，摇匀，分别吸取0.2ml置另两支试管中，各加硫酸2ml，摇匀，置水浴中加热2分钟，取出，立刻用冷水冷却，分别滴加10％愈创木酚的乙醇溶液1滴，振摇后,对照管显橙色。供试品管应显红色。
3.结果的判断 (1)乳酸鉴别试验呈正反应，牛奶呈正常凝固现象，供试品优良。
(2)乳酸鉴别试验呈正反应，牛奶呈不均匀的凝块，并分出大量乳清,凝块有汽泡及消化现象，表示有杂菌生长，供试品符合规定。
(3)乳酸鉴别试验呈负反应，牛奶呈不正常凝固或者不凝固，供试品不合格规定。
二、活乳酸菌数测定法
1.培养基的制备
(1)含糖牛肉汤培养基
牛肉浸液(或0.3％牛肉浸膏 1000ml
氯化钠 5g
胨 10g
乳糖 20g
取氯化钠、胨、乳糖加入牛肉浸液中，置水浴上加温，搅拌，使完全溶解，放冷至室温，调节pH值使灭菌后为6.0，115℃灭菌20分钟。
(2)含糖牛肉汤琼脂培养基 照含糖牛肉汤培养基处方的基础上,加溴甲酚紫0.06g,再加琼脂使每1000ml中含琼脂15～20g，在水浴上加热使溶解，分装后，115℃灭菌20分钟。
(3)20％碳酸钙混悬液　取极细结晶性的碳酸钙粉末,加水制成20％的混悬液,121℃灭菌20分钟。 更多：https://www.bmcx.com/
2.测定法 (1)供试品稀释液的制备 按无菌操作法，从两个包装供试品中，按各品种项下规定的取样量取样，加入盛有适量灭菌生理盐水和玻璃珠的锥形瓶中，振摇均匀，制成1：10的混悬液，用1ml的灭菌吸管稀释制成1：10<2>、1：10<3>、1：10<4>、1：10<5>与1：10<6>等各种稀释度的混悬液，每一稀释度吹洗三次，并更换吸管。
(2)接种与培养 用灭菌吸管吸取每种稀释度的混悬液1ml，吹入灭菌平皿中，每份接种二个平皿。
将20％碳酸钙混悬液置水浴中加温后，摇匀,趁热用灭菌吸管吸取5ml加至已溶化的含糖牛肉汤琼脂培养基100ml中,摇匀，放冷至45～55℃，取10～15ml加至上述已接种供试品稀释液的平皿中，随即转动平皿，使充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平板，在37℃培养72小时后，观察结果。有透明圈的菌落为乳酸菌。
(3)菌落计算 选取菌落分布均匀、菌落数为30～300个的平皿，计数菌落数。求得两个平皿的平均菌落数(若两个平皿的菌落数相差一倍以上，需重新试验)，再乘以供试品的稀释倍数，即为每1g乳酸菌制剂所含的活菌数。
三、乳酸菌鉴别法
1.运动性检查
(1)培养基 用活乳酸菌数测定法项下含糖牛肉汤培养基。
(2)鉴别法 自活乳酸菌计数的平皿中，选出具有透明圈的各种不同形态的菌落,每种选取两个菌落，分别接种至含糖牛肉汤培养基中，在37℃培养24小时后，应生长发育良好。取菌液，以悬滴检查法观察，应无运动性。
2.石蕊牛奶凝固试验 (1)石蕊牛奶培养基的制备 取牛奶培养基，每100ml中加入石蕊乙醇溶液2.5ml，混匀，取5～10ml分装于试管中，115℃灭菌20分钟。
(2)试验法 自上项含糖牛肉汤培养液中，取一白金耳菌液，种入5～10ml的石蕊牛奶培养基中，在37℃培养48小时，石蕊应还原为无色，牛奶应呈正常凝固现象，培养基上层表面应呈紫红色环。
3.显微镜检查 自上项含糖牛肉汤培养液中取菌液涂片，革兰氏染色后，于油镜下检查，记录其形态和革兰氏染色的颜色。
4.酸度测定及乳酸鉴别试验 自上项含糖牛肉汤培养液中取一白金耳菌液，种入牛奶培养基20ml中，另取对照用牛奶培养基20ml，同时在37℃培养48小时后，分别进行酸度测定及乳酸鉴别试验。
酸度测定法　取培养后的牛奶培养基5ml，置100ml的锥形瓶中，加水20ml和酚酞指示液3滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定至淡红色，并在1分钟内不褪色。
5.接触酶试验 自上项含糖牛肉汤培养液中取一白金耳菌液，种于含糖牛肉汤琼脂斜面上，在37℃培养48小时后，将3％过氧化氢溶液滴加于生长的菌落表面上,观察有无汽泡产生，有汽泡则为阳性反应，反之则为阴性反应。
注 牛肉浸液　取新鲜牛肉，除去肌腱和脂肪，切细，绞碎后，每1000g加水3000ml,充分搅匀，在2～10℃浸泡20～24小时后，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量,分装,121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。
石蕊乙醇溶液　取石蕊20g，研磨后置锥形瓶中，加入40％乙醇150ml，煮沸1分钟,倾出上层液，再加入40％乙醇150ml，煮沸1分钟，倾出上层液，与第一次倾出液合并，再加40％乙醇至全量为300ml。滴加1mol/L盐酸溶液，随加随振摇,至溶液变紫色为止。pH值应为6.0～6.8。
活乳酸菌计数　如在较小稀释度的培养基中所生长的菌落数量较多,菌落形态相似,呈极小点状或梭状；或在较大稀释度的培养基中菌落形态相似时，可能为乳酸菌生长，照乳酸菌鉴别法项下的悬滴检查法或石蕊牛奶凝固试验法鉴别，如为乳酸球菌，应不计算在内。