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书页号：S1-·62
标准编号：WS1-F03-89
本试验法包括牛奶凝固力、乳酸鉴别法、活乳酸菌数测定法及其鉴别法。
一、牛奶凝固力及乳酸鉴别法
1.牛奶培养基的制备　取新鲜牛奶，用蒸汽加热20分钟或置沸水浴中煮30分钟后，于冷处放置18小时以上，使乳脂析出，然后用虹吸管吸出脱脂溶液，分装试管中，每管20ml，用115.5℃蒸汽灭菌20分钟。
2.试验法　(1)牛奶凝固力　取供试品0.1～0.3g，加至牛奶培养基20ml中，摇匀，在37℃培养48小时，同时作两管，作为供试品管，以牛奶培养基为对照管，供试品管的牛奶应呈正常凝固现象（表面无多量乳清分出，凝块均匀稠密结实，无气体产生，无消化现象）。
(2)乳酸鉴别　取上述供试品管和对照管的培养液各1ml，分别注入两支试管 (15×160mm)中，各加10％硫酸3～5滴，振摇，加乙醚约10ml，猛烈振摇，放置数分钟，分别将上层乙醚液倒入两支试管(16×180mm)中，于热水浴中，除去乙醚。残留物中各加水2ml，摇匀，分别吸取0.2ml置另两支试管中，各加硫酸2ml，摇匀，置水浴中加热2分钟,取出,立刻用冷水冷却，分别滴入10％愈创木酚的乙醇溶液1滴,振摇后,对照管显橙色。
供试品管应显红色。
3.结果的判断 (1)乳酸鉴别试验呈正反应，牛奶呈正常凝固现象，供试品优良。
(2)乳酸鉴别试验呈正反应，牛奶呈不均匀的粉碎的凝块，并分出大量乳清,凝块有气泡及消化现象，表示有杂菌生长，供试品合格。
(3)乳酸鉴别试验呈负反应，牛奶呈不正常凝固或者不凝固，供试品不合格。
二、活乳酸菌数测定法
1.培养基的制备 (1)含糖牛肉汤培养基
牛肉浸液 1，000ml
氯化钠 5g
胨 10g
乳糖 20g
取氯化钠、胨、乳糖加入牛肉浸液中，置水浴上加温，搅拌，使完全溶解，放冷至室温，调节pH值使灭菌后为6.0，115.5℃灭菌20分钟。
(2)含糖牛肉汤琼脂培养基 照含糖牛肉汤培养基的处方，加琼脂使每100ml中含琼脂1.5～2g，在水浴上加热使溶解，分装后，115.5℃灭菌20分钟。 更多：https://www.bmcx.com/
(3)20％碳酸钙混悬液　取极细结晶性的碳酸钙粉末,加水制成20％的混悬液,121.5℃灭菌20分钟。
2.测定法　(1)供试品稀释液的制备 按无菌操作法，从两个包装供试品中，取样10g,加入灭菌生理盐水100ml，振摇均匀，制成混悬液，用1ml的灭菌吸管稀释制成1：100,1：1,000，1：10,000，1：100,000，1：1,000,000等各种稀释度的混悬液,每一稀释度吹洗三次，并更换吸管。
(2)接种与培养 用灭菌吸管吸取每种稀释度的混悬液1ml，吹入灭菌平皿中,每份同法接种二个平皿。
将20％碳酸钙混悬液置水浴中加温后，摇匀,趁热用灭菌吸管吸取5ml加至已溶化的含糖牛肉汤琼脂培养基100ml中,摇匀，放冷至45～55℃，取10～15ml加至上述已接种供试品稀释液的平皿中，随即转动平皿，使充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平板，在37℃培养72小时后，观察结果。有透明圈的菌落即为乳酸菌。
(3)菌落计算 选取菌落分布均匀、菌落数为30～300个的平皿，点数菌落的数目。
求得两个平皿的平均菌落数(若两个平皿的菌落数相差一倍以上，需重新试验)，再乘以供试品的稀释倍数，即为每1g乳酸菌制剂所含活菌数。
三、乳酸菌鉴别法
1.运动性检查 (1)培养基 用活乳酸菌测定法项下含糖牛肉汤培养基。
(2)鉴别法 自活乳酸菌计数的平皿中，选出具有透明圈的各种不同形态的菌落,每种选取两个菌落，分别种入含糖牛肉汤培养基中，在37℃培养24小时后，应生长发育良好，取菌液，以悬滴检查法观察，应无运动性。
2.石蕊牛奶凝固试验　(1)石蕊牛奶培养基的制备 取牛奶培养基,每100ml中加入石蕊乙醇溶液2.5ml，混匀，取5～10ml分装于试管中，管115.5℃灭菌20分钟。
(2)试验法 自上项含糖牛肉汤培养液中，取一白金耳菌液，种入5～10ml的石蕊牛奶培养基中，在37℃培养48小时，石蕊应还原为无色，牛奶应呈正常凝固现象，培养基上层表面应呈紫红色环。
3.显微镜检查　自上项含糖牛肉汤培养液中取菌液涂片，革兰氏染色后，于油镜下检查，记录其形态和革兰氏染色的颜色。
4.酸度测定及乳酸鉴别试验　自上项含糖牛肉汤培养液中取一白金耳菌液，种入牛奶培养基20ml中，另取对照用牛奶培养基20ml，同时在37℃培养48小时后，分别进行酸度测定及乳酸鉴别试验。
5.接触酶试验　自上项含糖牛肉汤培养液中取一白金耳菌液，种于含糖牛肉汤琼脂斜面上，在37℃培养48小时后，将3％过氧化氢溶液滴加于生长的菌落表面上,观察有无气泡产生，有气泡则为阳性反应，反之则为阴性反应。
新鲜牛奶　取比重在1.028以上的牛奶5ml与水20ml，置50～100ml的锥形瓶中,加酚酞指示液3滴,用氢氧化钠液(0.1mol/L)滴定至显示的淡红色在1分钟内不完全消失为止。一般新鲜牛奶所消耗的氢氧化钠液(0.1mol/L)不得超过1.0ml。
乳酸菌的酸度测定　照上法测定。
牛肉浸液　取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后，每1,000g加水3,000ml,充分拌匀，在2～10℃浸泡20～24小时后，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量，分装，121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。也可用牛肉浸膏3g，加水1,000ml，配成溶液代替。
活乳酸菌计数　如果在较小稀释度培养基中所生长的菌落数量较多,菌落形态相似,呈极小点状或梭状，或在较大稀释度培养基中菌落形态相似时，可能为乳酸菌生长，照乳酸菌鉴别法项下的悬滴检查法或石蕊牛奶凝固试验法鉴别，如为乳酸球菌，应不计算在内。
石蕊乙醇溶液　取石蕊20g，研磨后置锥形瓶中，加入40％乙醇150ml，煮沸1分钟,倒出上层液，再加入40％乙醇150ml，煮沸1分钟，倒出上层液，与第一次倒出液合并。
再以40％乙醇加至全量为300ml.滴加盐酸液(1mol/L),随加随振摇,至溶液变紫色为止。
pH值应为6.0～8.0。